fa کلونینگ و بیان ژن نانوبادی علیه انتروتوکسین B باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ايمونولوژي Immunology پژوهشي Research <p dir="RTL"><strong>زمینه و هدف</strong>: باکتری <em>استافیلوکوکوس</em> <em>اورئوس</em> با ترشح انتروتوکسین‌های متعدد باعث بیماری‌های مختلف می‌شود، به همین دلیل روش‌های مؤثر و آسان شناسایی انتروتوکسین&shy;ها موردنیاز است. امروزه غالباً از روش‌های ایمونوشیمیایی برمبنای آنتی‌بادی‌های مونوکلونال استفاده می‌شود. در سرم خون خانواده شترسانان آنتی‌بادی‌های زنجیره سنگین یافت شده که <span dir="LTR">VHH</span> یا نانوبادی نامیده می‌شوند. خصوصیات منحصربه‌فرد این آنتی‌بادی‌ها از قبیل اتصال به مولکول‌های کوچک نظیر توکسین‌ها، آن‌ها را کاندیدهای جذابی برای توسعه ترکیبات دارویی نموده است. برای دستیابی به مولکول <span dir="LTR">VHH</span> علیه انتروتوکسین <span dir="LTR">B</span> <em>استافیلوکوکوس</em> تحقیق حاضر انجام‌ شده ‌است.</p> <p dir="RTL"><strong>مواد و روش‌ها</strong>: غنی‌سازی کتابخانه‌ی فاژی به‌منظور جداسازی نانوبادی‌های اختصاصی علیه توکسین در کارهای قبل انجام‌شده بود<span dir="LTR">.</span> در ادامه وکتور<span dir="LTR"> pCANTAB 5E</span> &nbsp;حاوی <span dir="LTR">VHH</span> از باکتری <span dir="LTR">E</span><em><span dir="LTR">.coli</span></em> سویه <span dir="LTR">xl1blue</span>، استخراج و پس از انجام واکنش <span dir="LTR">PCR</span> با پرایمرهای مربوطه، ساب‌کلونینگ در وکتور بیانی (+)<span dir="LTR">pET21a</span> با مکان‌های برش <span dir="LTR">Nde</span><span dir="LTR">I</span> و <span dir="LTR">Xho</span><span dir="LTR">I</span> صورت گرفت. ترانسفورماسیون وکتور درون باکتری <em><span dir="LTR">E.coli</span></em> سویه بیانی <span dir="LTR">(DE3)</span> <span dir="LTR">BL2I</span> انجام شد. سپس سلول‌ها تحت القای <span dir="LTR">IPTG</span> قرار گرفتند و زمان و شرایط تولید بهینه گردید، درنهایت بیان پروتئین توسط تکنیک <span dir="LTR">SDS-PAGE</span> و وسترن بلات مورد ارزیابی قرار گرفت.</p> <p dir="RTL"><strong>نتایج</strong>: برای تأیید کلونینگ ژن نانوبادی درون وکتور <span dir="LTR">pET21a(+)</span>، توالی نوکلئوتیدی ژن آنالیز و ترانسفورم به باکتری <em><span dir="LTR">E.coli</span></em> سویه <span dir="LTR">DE3</span><span dir="LTR">)</span>)<span dir="LTR">BL21</span> با موفقیت انجام شد<span dir="LTR">.</span> پس از القاء، پروتئین فعال درون سلول توسط روش <span dir="LTR">SDS-PAGE</span> مشاهده و توسط لکه‌گذاری وسترن تأیید شد.</p> <p dir="RTL"><strong>نتیجه‌گیری</strong>: در این تحقیق کلونینگ، ساب کلونینگ و بیان ژن نانوبادی انجام شد. تولید این پروتئین نوترکیب می‌تواند گامی مهم در جهت توسعه روش‌های درمانی جدید و یا تولید واکسن علیه انتروتوکسین <span dir="LTR">B</span> باکتری <em>استافیلوکوکوس </em>اورئوس بردارد.</p> <p><strong><em>Background & Objectives:</em></strong> <em>Staphylococcus </em><em>aureus</em> bacteria causes many different diseases by secretion of various enterotoxins. Therefore, it is necessary to develop ways that facilitate the detection of enterotoxins. Nowadays, immunochemical methods which are based on monoclonal antibody technology are used. The heavy chain antibodies that are called VHH or Nano body were found in blood serum of the <em>Camelidae </em>family. The unique properties of this antibody such as their binding to small molecules like toxins make them attractive candidates for the development of immunodiagnostic tests. The present study was done to achieve a VHH molecules against Staphylococcus enterotoxin B.</p> <p><strong><em>Materials & Methods:</em></strong> Freighting phage library for isolate private Nano bodies against enterotoxin B was done in previous works. Next, pCANTAB 5E vector that consists VHH, extracted from <em>E.coli</em> bacteria strain xl1blue, and after doing PCR process with relative primers, sub cloning in pET21a(+) as an expression vector with cut sites NdeI and XhoI was done. Transformation in <em>E.coli</em> bacteria strain BL21(DE3) was done. Then, the cells effected with IPTG and producing time, and other terms were optimized. Finally, the expression of the protein with SDS-PAGE and western blot techniques was evaluated.</p> <p><strong><em>Result:</em></strong> For proving cloning of nano body gene in pET21a (+) vector, nucleotide sequence of gene was analyzed, and transforming to <em>E.coli</em> bacteria strain BL21(DE3) was successful. After inspiration, active protein in cell was seen by SDS-PAGE technique and proved by western blot.</p> <p><strong><em>Conclusion:</em></strong> cloning, sub cloning, and nonabody expression were surveyed in this research. Production of this protein can help to develop new therapeutic methods and produce vaccine against enterotoxin B of <em>Staphylococcus aureus</em></p> نانوبادی,VHH , انتروتوکسین B, استافیلوکوکوس اورئوس Nanobody, VHH, Entrotoxin B, Staphylococcus aureus 496 503 http://jabs.fums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1177-1&slc_lang=fa&sid=1 Zahra Tavassoli زهرا توسلی 100319475328460018005 100319475328460018005 No Department of biotechnology, Malek Ashtar university, Tehran, Iran پژوهشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران Hamideh Rouhani Nejad حمیده روحانی نژاد 100319475328460018006 100319475328460018006 No Department of biotechnology, Malek Ashtar university, Tehran, Iran پژوهشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران Jalil Fallah Mehrabadi جلیل فلاح مهرآبادی jalil.fallah@gmail.com 100319475328460018007 100319475328460018007 Yes The Lister Laboratory of Microbiology, Tehran, Iran آزمایشگاه میکروب‌شناسی لیستر، تهران، ایران